【微生物限度方法适用性】微生物定性替代检验方法的验证

1、专属性

微生物定性检验的专属性是指检测样品中可能存在的特定微生物种类的能力。当替代方法以微生物生长作为判断微生物是否存在时，其专属性验证时应确认所用培养基的促生长试验，还应考虑样品的存在对检验结果的影响。当替代方法不是以微生物生长作为判断指标时，其专属性验证应确认检测系统中的外来成分不得干扰试验而影响结果，如确认样品的存在不会对检验结果造成影响。采用替代方法进行控制菌的检验，还应选择与控制菌具有类似特性的菌株作为验证对象。

2、检测限

微生物定性检验的检测限是指在替代方法设定的检验条件下，样品中能被检出的微生物的较低数量。由于微生物所具有的特殊性质，检测限是指在稀释或培养之前初始样品所含有的微生物数量，而不是指检验过程中某一环节的供试液中所含有的微生物数量。

检测限确定的方法是在样品中接种较低浓度的试验菌(每单位不超过5cfu)，然后分别采用药典方法和替代方法对该试验菌进行检验，以检出与否来比较两种方法的差异。试验菌接种量须根据试验而定，以接种后采用药典方法50%的样品可检出该试验菌为宜。检测限验证至少应重复进行5次。对于同一种试验菌可釆用卡方检验来评价两种方法的检测限是否存在差异。

3、重现性

重现性可视为微生物检验方法在检验结果上抵抗操作和环境变化的能力。方法使用者应优先测定该验证参数。在样品中接种一定数量的试验菌（接种量应在检测限以上），采用药典方法和替代方法，分别由不同人员，在不同时间，使用不同的试剂（或 仪器）进行检，采用卡方检验(f)来评价两种方法的重现性是否存在异。验证过程中，应关注样品的一致性。

4、耐用性

与药典方法比较，若替代方法检验条件较为苛刻，则应在方法中加以说明。替代方法与药典方法的耐用性比较不是必须的，但应单独对替代方法的耐用性进行评价，以便了解方法的关键操作点。

2-样品中微生物定量检验方法的验证

1、准确度

微生物定量检验的准确度是指替代方法的检验结果与药典方法检验结果一致的程度，通常用微生物的回收率（％)来表示。

准确度验证的方法：制备试验菌的菌悬液，菌悬液的浓度应选择为能够准确计数的较高浓度，然后系列稀释至较低浓度（如小于10cfu/ml)。例如，菌落计数平皿法的替代方法，在制备髙浓度菌悬液时其浓度是103 cfu /ml，系列稀释至100cfu/ml。每个试验菌应至少选择5个菌浓度进行准确度确认，替代方法的检验结果不得少于药典方法检验结果70% ，也可以采用合适的统计学方法表明替代方法的回收率至少与药典方法一致。当替代方法的回收率高于药典方法时，有必要结合专属无菌检查方法适用性。

2、精密度

精密度验证的方法是：制备试验菌的菌悬液，齒悬液的浓度应选择为能够准确读数的较高浓度，然后系列稀释至较低浓度（如小于10cfu/ml)。每个试验菌选择其中至少5个浓度的菌悬液进行检验。每一个浓度至少应进行10次重复检验，以便能够采用统计分析方法得到标准偏差或相对标准偏差。

3、专属性

专属性验证应证明当样品中存在一定数量的试验菌时，通过平皿法检验，能够检出试验菌，而样品的存在不会对结果造成影响。专属性验证时，应能够设计出可能使替代方法出现假阳性的实验模型来挑战替代方法。当替代方法不依赖微生物生长出菌落或出现混浊就可以定量时(如不需要增菌或在1〜50cfu范围内就可直接测定菌数的定量方法），以上验证方式就显得更为重要。

4、定量限

定量限验证的方法是：在检验范围的低限制备5 份不同含菌浓度的菌悬液，每份菌悬液分别用药典方法和替代方法进行不少于5 次检验，采用统计方法比较替代方法的检验结果与药典方法结果的差异，从而评价替代方法的定量限。

5、线性和范围

线性验证时必须覆盖能够准确测定的所有浓度范围。每株试验菌应选择至少5个浓度，每个浓度至少测定5次。根据以上实验数据，以检验结果为因变量，以样品中微生物的预期数量为自变量进行线性回归分析，计算相关系数r。替代方法的相关系数不得低于0.95。

微生物定量检验的范围是指能够达到一定的准确度、精密度和线性，检验方法适用的髙低限浓度或数量的区间。

6、重现性

在样品中接种一定数量的试验菌（接种量应在定量限以上），采用药典方法和替代方法，分别由不同人员，在不同时间，使用不同的试剂（或仪器）进行检验，对检验结果进行统计分析，以相对标准偏差（RSD) 来评价两种方法的重现性差异。

7、耐压性

替代方法与药典方法的耐用性比较不是必须的，但应单独对替代方法的耐用性进行评价，以便了解方法的关键操作点。